干細胞治療肌萎縮側索硬化癥的研究進展
中山大學附屬第一醫院神經科 劉強 姚曉黎
摘要：肌萎縮側索硬化癥是一種致死性神經變性疾病，尚無有效治療措施。干細胞由于其具有分化成運動神經元的潛能，受到極大的關注。用于ALS治療的干細胞有胚胎干細胞、神經干細胞、骨髓間充質干細胞、臍帶血非造血干細胞及誘導產生多能性干細胞。其治療的作用機制主要分為三種：細胞替代, 神經營養因子釋放和免疫調節。
關鍵詞：肌萎縮側索硬化癥 干細胞治療細胞替代 神經營養因子釋放 免疫調節
基金項目：廣東省博士啟動基金資助項目（編號：5300783）；廣東省科技計劃項目（編號：2006B36003003）。
通訊作者：姚曉黎，E-mail: yeyaoxiaoli@sohu.com
肌萎縮側索硬化（ALS）是一種進行性神經變性疾病，由于上、下運動神經元變性導致延髓、四肢、軀干、胸部及腹部肌肉逐漸無力和萎縮，多因呼吸肌麻痹而死亡。目前尚無有效的治療方法，力魯唑（riluzole）為Glu拮抗劑，可使ALS病人的生存期平均延長3個月，是目前唯一被美國FDA批準的臨床藥物【1】。其他的治療措施還包括維生素、神經營養因子及基因治療等【2】，但是都只減慢而不能阻止疾病進展。
最新的研究表明，組織特異性干細胞具有分化成其他細胞或組織的潛能，可以分化為運動神經元，這為ALS的治療開創了更廣泛的空間。目前對于干細胞治療的作用機制分為三種：細胞替代（cell replacement）,神經營養因子釋放（trophic factors delivery），免疫調節（immunomodulation）。細胞替代理論源于選擇性采用有功能的細胞替代變性神經元可以得到臨床體征的長期改善。移植的細胞存活，整合到內生的神經網絡，然后導致功能改善。釋放營養因子是一種更為實用的短期方法，干細胞治療的有效性歸因于產生的神經營養因子能夠支持細胞生存、誘導內生的細胞增殖、促進神經纖維再生。第三種理論源于最近研究認為神經系統的炎癥在神經變性病的發病機理中起重要作用。慢性炎癥的抑制能夠解釋干細胞移植的積極效果【3】。
現將近年關于ALS干細胞治療研究進展綜述如下。
1、治療ALS的干細胞種類
干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，能夠產生至少一種類型的、高度分化的子代細胞。干細胞按照生存階段分為胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESC)和成體干細胞（somatic stem cell）。干細胞的發育受多種內在機制和微環境因素的影響。用于ALS治療的干細胞有胚胎干細胞、神經干細胞、骨髓間充質干細胞和臍帶血非造血干細胞等。
1.1 胚胎干細胞
胚胎干細胞是指由胚胎內細胞團（inner cell mass,ICM）或原始生殖細胞（primordial germ cell,PGC）經體外抑制培養而篩選出的細胞。胚胎干細胞（ES細胞）是一種高度未分化細胞。它具有發育的全能性，能分化出成體動物的所有組織和器官。但是人胚胎干細胞應用于臨床面臨倫理及形成畸胎瘤等復雜因素【4】。
1.2 神經干細胞
神經干細胞（neural stem cell,NSCs）指來源于神經系統, 具有自我更新能力。在特定條件誘導下能夠向神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞分化的潛能【5】。
1.3 骨髓間充質干細胞
骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells , MSCs)具有多向分化潛能，能分化成神經元 、神經膠質細胞。因MSCs 具有獲取簡便,對供體損傷小,增殖力強,來源廣泛，具有遷移至組織損傷部位的能力；很強的免疫抑制特點，可自體移植，也可異體移植等優點【6】, MSCs 向神經細胞的分化為ALS的治療帶來新的希望【7】。
1.4 臍帶血非造血干細胞
臍帶血非造血干細胞（umbilical cord blood-derived stem cells）具有多向分化潛能,其在體外條件培養下可以分化為具有神經細胞和神經膠質細胞特征的細胞[1 ] ;植入到大鼠腦內可分化成膠質細胞或神經元【8】。與hMSC和hMSC-NSCs比較，臍帶血細胞在CSF中生存率較低，在蛛網膜下僅看到很少的細胞，在腦組織中沒有發現細胞【9】。
1.5 誘導產生多能性干細胞
最近, 將人類體細胞誘導成為多能性干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）的研究成果在生命科學領域引起了一次轟動, 分化的細胞可以通過少數幾個基因的外源導入而被重編程到具有多能性的狀態,其意義在于可以將患者的體細胞重編程為多能干細胞，再分化為特異性的運動神經元。iPS類似于人的ES，具有多能性，可分化為各種細胞，但可繞過ES的倫理學爭論，從而成為具有患者特異性的細胞【10】。
2、替代治療
2.1 直接的運動神經元替換要求移植的細胞不僅能分化為運動神經元,而且能被受者的中樞神經系統神經元識別和連接,通過合適的神經纖維發出軸突在肌細胞形成突觸，恢復運動傳導通路【10】。
通過誘導因子如維甲酸、音猬因子，可以將小鼠ESCs誘導成類膽堿功能神經元【11】。還有研究報道在雙丁酰cAMP的處理下小鼠ESC源性運動神經元將軸突延伸到前根【12】。然而，即使經過這種處理，這些軸突也限制在移植神經元的附近前根，也沒有發現神經肌肉接頭【11】。Nakamura et al.(2005)采用體外神經環境，發現胚胎脊髓前體細胞細胞移植到損傷的新生鼠脊髓可以幸存，遷移，分化為神經元，少突膠質，但是很少分化為星形膠質。而且，這些細胞的移植可以促進運動和反射反應的恢復【13】。Erb et al.(1993)報道，移植的運動神經元可以存活最多18周，重新使失神經的肌肉神經化【14】。但是Kerr和同事通過實驗發現大多數人胚胎干細胞移植到大鼠后，保持未分化狀態，只有很少一些變成類膽堿功能的，不會分化為運動神經元或者與肌肉建立聯系【15】。
NPCs能夠分化為CNS中三種主要的成熟細胞類型：神經元、星形膠質和少突膠質【16】。Wu和合作者在體外將人胎兒的NSCs分化為類膽堿運動神經元，移植到脊髓，首次證明人胎兒的NSC發出軸突與外周肌肉形成神經聯系，這個發現與運動功能的部分改善有關，揭示慢性運動神經元變性的成年大鼠仍然存在形成新的神經聯系的合適的環境條件【17】。
MSCs能分化為非間充質系,具有很好的可塑性。已經有證據表明，MSCs能在體內體外分化為神經元和膠質細胞【18】。在缺乏酸性神經磷脂酶的老鼠，移植MSCs可以延遲神經異常的發病，延長生存期【19】。但是H.-J. Habisch沒有觀察到移植hMSC、hUBC能延長ALS鼠的生存時間。處理組和對照組的ALS鼠都死于130天左右，且兩組腰段脊髓未發現神經元數目的不同。可能原因是移植細胞的數量【9】。 Garbuzova-Davis et al.（2003）; Corti et al.（ 2004)移植后可在CNS或外周血管看到大約1.5％的全部細胞類型【19 20】，而H.-J. Habisch僅看到單個細胞，原因可能是注射部位不同，前者是注入外周血管，而后者是注入CNS。對此結果可能有兩點解釋，移植到CNS的細胞數目、腦和脊髓部位細胞的歸巢和分化。移植后十天觀察到大多數細胞在蛛網膜下，主要分布在枕大池和基底池附近，很少的細胞在第四腦室和脊髓周圍。研究發現，hMSCs體內移植對癥狀前的運動表現有利，但是考慮到生存時間或疾病進展，hMSCs和hUBCs沒有產生主要的治療作用【9】。
臨床上Mazzini et al. (2003)進行了一項研究，以檢驗在ALS進行MSCs移植的效果。研究組選了7個有嚴重下運動神經體征和輕度上運動神經體征的ALS。從每個病人取一部分骨髓進行MSC培養，3到4周后將細胞懸浮在自體的腦脊液中從外科暴露的脊髓T7–T9水平直接移植。移植后沒有病人出現嚴重不良反應。分別在移植后3月和6月行MRI檢查，沒有發現脊髓結構改變和異常細胞增殖。在4個患者的下肢近段肌群觀察到肌力減弱呈輕度減緩的趨勢，這個效應與移植細胞的數目相關【21】。骨髓間充質細胞很容易從ALS的骨髓中分離到，長期觀察已經證實自體同源MSCs的培養擴充和移植入人的脊髓是安全的，在ALS病人可以耐受。長期觀察還發現用力肺活量FVC和ALS-FRS的下降在至少50％的病人中移植后顯著減慢【22】。
2.2 盡管運動神經元的變性是ALS主要病理特點,但其它類型細胞也受到影響。Terao et al. （1994)發現隨疾病進展脊髓中間神經元也變性【23】，而且減少的脊髓中間神經元本身也能造成截癱【24】。這樣，因為中間神經元的減少，很有可能接受胚胎干細胞來源的功能性運動神經元的移植后ALS病人的癱瘓仍舊存在，如此，同樣需要這些中間神經元的替代【25】。
死亡的運動神經元的功能替代被證明很難，不論是整合到脊髓環路還是促進新的軸突向肌肉的生長。然而采用膠質細胞的干細胞治療可能是一個成功的方法，特別是基于膠質細胞在改善神經病理中的角色。已經知道運動神經元周圍的膠質細胞調節運動神經元的存活【2】。有報道，增加過表達變異SOD1運動神經元周圍的非神經元細胞能夠減少SOD1導致的病理狀態【26】。變異的非神經元細胞能引起運動神經元的病理改變，單獨的運動神經元變異SOD1表達不足以引起神經元變性【27 28】。這些結果提示膠質細胞的干細胞替代治療對改變疾病進展有幫助。
最新研究認為星形膠質分泌一種毒素殺傷運動神經元，從而認為星形膠質是導致ALS運動神經元死亡的元兇。以Kevin Eggan為首的哈佛研究小組從表達正常人SOD1 基因和表達突變SOD1基因的鼠胚泡中培養胚胎干細胞，然而分化為運動神經元。他們發現即使正常的神經元在有SOD1突變基因的星形膠質細胞的出現下，14天后會有50％的減少。相反的條件下，突變的運動神經元在正常星形膠質的圍繞下，其減少的程度遠沒有那么嚴重【29】。Serge Przedborski等的研究更為深入，他們證明了這種特殊毒素來源于星形膠質細胞。他們發現將運動神經元培養在星形膠質細胞培養后的培養基上，與直接暴露于星形膠質的結果一樣，這種結果提示該毒素是膠質細胞分泌的。他們指出SOD1蛋白和谷氨酸鹽跟這種毒素可能相同【30】。
3、營養支持和神經保護
研究發現具有神經保護作用的營養因子包括膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）、胰島素樣生長因子－1（IGF-1）、血管內皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子（HGF）、心肌營養素-1（CT-1）、白血病抑制因子（LIF）、睫狀神經營養因子（CNTF）、腦源神經營養因子（BDNF）、神經生長因子-3（NT-3）【31】。
近十年大量的文獻報道在實驗室將NSCs分離、增殖、純化，然后移植到神經變性病的模型中。然而，多數實驗觀察到的有利效果并非來自于細胞替代或移植細胞在神經微環境中的起效，而是來自于釋放能夠刺激或抑制內生細胞的活動的能力。雖然不少研究者將ESC或NSC在體外分化為神經元，但有學者發現ESCs或組織源性NSCs在成年小鼠脊髓內不形成典型運動神經元，推測可能是缺乏足夠的環境因素【11】。也有研究認為ALS鼠的剩余腦成體NSCs和祖細胞仍然正常，而且到疾病晚期仍然存在并行使重要的NSC功能。也認為NSCs所處的微環境(niche)在增殖能力和表型特征存在間斷改變，使得NSCs比神經祖細胞更易受影響。盡管mSOD1小鼠的神經祖細胞數量正常，但是新生的神經元的存活受到限制，這樣會阻礙細胞募集和神經元的替代治療，應該通過改變細胞微環境來替代變性的上運動神經元【32】。Kerr DA同樣認為干細胞治療的積極結果主要是干細胞分化為膠質細胞樣細胞，為運動神經元提供營養因子，而不是直接的神經元替代【15】。
體外修飾的人神經祖細胞移植到SOD1轉基因鼠脊髓后分泌GDNF出現癥狀的輕度改善【33】。輸注膠原細胞源性神經營養因子(GDNF) 血管內皮生長因子(VEGF), 胰島素樣生長因子-1(IGF-1)能保護ALS動物模型運動神經元，增加動物的生存時間【25 34】。在一些實例中NSCs移植主要分化為移植源性的星形膠質，偶爾分化為少突膠質，提示治療效果是星形膠質提供（分泌）的營養因子【35】或者移植源性少突膠質對軸突重新髓鞘化作用【36】。
除了神經膠質細胞，肌肉也能為運動神經元和軸突提供營養支持【37】。而且發現去神經的骨骼肌分泌神經營養因子減少，包括BDNF、NT-3、NGF、CT-1、HGF、GDNF。加速的軸突缺失和功能異常是因為運動神經元缺乏這些營養因子，由此發現成肌細胞通過改善GDNF的分泌預防運動神經元的變性【38】。
在疾病出現癥狀前，移植hNPC釋放GDNF能維持將近100％的運動神經元，否則這些神經元會減少到正常值的30％。即使在癥狀晚期，GDNF也能維持至少30％的運動神經元，這個水平足以防止癥狀的發生。然而肌肉的神經支配并沒有看到相似結果，肢體功能也沒有改變。
hNPC產生的GDNF能調節運動神經元的存活【39】。在ALS，病人和SOD1鼠的脊髓都有膠質細胞的活化增生【40】。假設膠質細胞的反應性增生繼發于運動神經元的死亡，很有可能如果移植側一定數量的神經元復活，會減少膠質細胞的增生。但是發現移植側和對照側的星形膠質沒有減少，還觀察到小膠質的高反應性。那么，GDNF的保護作用不是通過調節宿主反應性星形膠質細胞介導的，GDNF在一個高反應環境促使表達SOD1蛋白的運動神經元存活。被GDNF調節的類膽堿功能的運動神經元甚至沒有開始表達細胞凋亡的早期標志如ubiquitin。作者認為GDNF可能與hNPC分泌的其他因子共同作用激活宿主運動神經元的與抗凋亡蛋白聯系的細胞保護通路【39】。
4、抑制炎癥反應
McGeer (2002)提供了大量的證據證明在ALS的受累組織中存在活化的小膠質、星形膠質和白細胞滲透。小膠質細胞參與的過度固有免疫防衛創造了一個不利于宿主組織生存的炎癥環境【3 41】。小膠質細胞的活化信號是該該炎癥反應的啟動因素，抑制小膠質細胞活化的抗生素，如二甲胺四環素minocycline可以減少神經損傷后的炎癥反應【42】。有研究者報道混合免疫抑制劑或者CD4抗體能延長人神經干細胞移植的存活，混合免疫抑制劑和CD4抗體能夠阻斷IL－2的產生，抑制移植區域CD4、D8細胞募集以及削弱小膠質細胞的吞噬反應來保護NSC移植物的。同時免疫抑制能夠為移植的干細胞分化為神經元、建立與宿主神經元的網絡提供足夠的時間，從而改善ALS轉基因鼠的疾病結果，表現為發病延緩、運動神經元疾病進展緩慢、生存時間較長【43】。
移植后的健康運動神經元能否在活化的小膠質細胞和其它炎癥反應的有害（不利）環境中存活。帕金森和亨廷頓病的移植研究表明移植的多巴胺能神經元和紋狀體神經元可以長期存活并行使功能,而不受疾病的影響【25】。已經有很多研究報道關于骨髓來源的MSCs在體內體外具有免疫抑制的特性【44】。Ryan et al.（2005)詳盡論述了移植的MSCs遇到一個陌生的炎癥環境，可能誘導免疫調節過程限制炎癥以利于自我生存，作用機理可能是分泌一些可溶性因子以形成一個免疫抑制微環境【45】。
5、展望
雖然動物研究和部分臨床試驗證明干細胞對神經變性疾病的治療非常有潛力，但是，干細胞治療在臨床廣泛應用之前還有很長的一段路要走。到目前為止，人們對干細胞的了解仍存在許多盲區,還有許多問題需要解決。對ALS的病因研究的更多了解能為干細胞治療提供更多幫助。隨著基因工程、胚胎工程、細胞工程等各種生物技術的快速發展，干細胞研究領域向深度和廣度不斷擴展，人們對干細胞的了解也將更加全面。21世紀是生命科學的時代，也是為人類的健康長壽創造世界奇跡的時代，干細胞的應用將有更加廣闊的前景。
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